LBV207U-TEMEL VETERİNER PATOLOJİ
Ünite 3: Boyama ve Mikroskoplar
Boyama Yöntemleri (Histokimya)
Boyama yöntemleri nekropsi ve biyopsi sonucu elde edilen doku örneklerinde gelişen patolojik bulguların mikroskobik olarak belirlenmesi ve görünür hale getirilmesi amacıyla yapılan özel kimyasal uygulama yöntemleridir.
Histokimya, laboratuarda çeşitli kimyasal maddeler kullanarak ve dokuda birtakım kimyasal reaksiyonlar oluşturulmasıyla doku ve elemanlarını ayırt etmeye yerleşim ve yayılımları ile miktarlarını tanımaya yarayan kimyasal yöntemlerin adı olarak tanımlanır.
Patoloji Laboratuarlarında Kullanılan Rutin Hematoksilen-Eozin Boyama Yöntemi
Hematoksilen boyası genellikle hücre çekirdeğini koyu mavi-mor renge boyayarak hücre içi ayrıntıyı iyi gösterir. Eozin boyası ise hücre sitoplazmasını pembekırmızı renge boyar. Bazik bir boya olan hematoksilenin oksijenleşmesiyle ortaya çıkan hematein kırmızımtrak-sarı renkte zayıf bir boyadır. Ancak bir mordant ile kullanılırsa koyu ve devamlı bir boya olur.
Mordant: Boya ile iyi bir birleşim oluşturarak boya doku bağlanmasını kolaylaştıran maddedir.
Aluminyum Alum Hematoksilenler: En sık kullanılan boyama tipidir ve hücre çekirdeğini iyi boyamaktadır. Aluminyumlu hematoksilenlerin tüm formülasyonları progresif ve regresif boyama yapar.
Eozin; Rutin histopatolojik boyamada aluminyum hematoksilene zıt boya olarak ve hücre sitoplazma yanında bağ dokunun da boyamasında kullanılır.
Zıt Boya: Dokuda boyanması gereken kısımların daha iyi görünmesi amacıyla, diğer yapıların farklı bir boya ile boyanmasıdır.
Özel Boyama Yöntemleri
Konnektif ve Kas Dokusu Boyaları
a) Masson’un Trikrom Boyası
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin veya Bouin solüsyonu (Suda doymuş pikrik asit solüsyonundan 75 mL ve %37-40’lık formaldehitten 25 mL karıştırılarak üzerine 5 mL glasial asetik asit ilave edilir).
Bloklama: Parafin (kesitler 5 μm)
Sonuçlar: Çekirdekler: Koyu leylak rengi mavi veya siyah (boya taze iken)
Sitoplazmik yapılar, kas dokusu, epitel doku
Keratin: Değişen tonlarda kırmızı ve leylak rengi
Kollagen demetler: Koyu mavi.
b) Van Gieson Boyası
Tespit: Genel bir tespit solüsyonu.
Bloklama: Parafin (kesitler 5 μm).
Sonuçlar: Çekirdekler: Koyu maviden siyaha kadar
Kollagen iplikler: Kırmızı
Kas, epitel doku, eritrositler: Sarı.
Yağ ve Karbonhidrat Boyaları
a) Oil Red O Boyası
Tespit %10’luk tamponlu nötral formalin veya sulu genel bir tespit solüsyonu.
Bloklama: Dondurma mikrotomunda (Kriostat) 10-15 μm
Sonuçlar: Yağlar: Turuncu-kırmızı veya parlak kırmızı
Çekirdekler: Mavi.
b) Best’in Carmine (Glikojen) Boyası
Tespit: Alkolik formalin (9 kısım saf alkol-1 kısım %37- 40’lık formaldehit) veya %5’lik asetik aside ilaveten %10’luk formalin alkol. Suda nötral %10’luk formalinle genellikle iyi sonuçlar elde edilebilir.
Bloklama: Tercihen parafin kesitler (5 μm).
Sonuçlar: Glikojen: Kırmızı
Mast hücre granülleri, musin ve fibrin: Açık kırmızı. Çekirdekler: Mavi.
Pigment ve Mineral Boyaları
a) Lillie’in Nil Mavisi Boyası
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin veya genel bir tespit solüsyonu.
Bloklama: 5 μm parafin kesitler.
Sonuçlar: Lipofuskinler: Koyu mavi veya mavi-yeşil
Melanin pigmenti: Açık yeşil
Eritrositler: Yeşilimsi-sarı veya yeşilimsi-mavi Myelin: Yeşil ile koyu mavi arası
Çekirdekler: Zayıf veya hiç boyanmaz.
b) Von Kossa Boyası
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin.
Bloklama: 5 μm parafin kesitler.
Sonuçlar: Kalsiyum tuzları: Siyah
Çekirdekler: Kırmızı
Sitoplazma: Gül pembesi.
Amiloid Boyası
a) Kongo Kırmızısı Boyası
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin.
Bloklama: 5 μm parafin kesitler.
Sonuçlar: Amiloid: Solgun pembeden kırmızıya kadar.
Çekirdekler: Mavi.
Mikroorganizmaların Boyası
a) Gram-Weigert Boyası
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin.
Bloklama: 5 μm parafin kesitler.
Sonuçlar: Gram-pozitif bakteri ve mantar
Mor Gram-negatif organizmler: Genellikle boya almaz.
Fibrin: Mavi-siyah.
b) Ziehl-Neelsen Boyası
Tespit: Genel bir tespit solüsyonu.
Bloklama: 5 μm parafin kesitler.
Sonuçlar: Asit-fast bakteriler: Parlak kırmızı
Alyuvarlar (Erythrocyte): Sarımsı-turuncu
Diğer doku elemanları: Soluk mavi.
c) Gridley Mantar Boyası
Tespit: Genel bir tespit solüsyonu.
Bloklama: 5 μm parafin kesitler.
Sonuçlar: Mantar miselyumları: Koyu mavi.
Mantar konidiaları: Koyu pembeden mora kadar
Elastik doku ve musin: Koyu mavi
Zemin: Sarı
Sinir Dokusu Elemanları Boyaları
a) Holzer Boyası (Glia hücre ve iplikleri için)
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin.
Bloklama: 8-10 μm parafin kesitler.
Sonuçlar: Glia hücre ve iplikleri koyu menekşe
Zemin: Açık menekşe.
b) Luxol Fast Blue Boyası (Myelin iplikleri için)
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin.
Bloklama: 8-10 μm parafin kesitler.
Sonuçlar: Myelin: Mavi-yeşil.
Mantar ve PAS pozitif elementler: Pembeden kırmızıya
Çekirdekler: Koyu mavi
Sitoplazmik nükleoproteinler: Mavimsi mor
Kapillarlar: Kırmızı
Mikroskoplar
Mikroskop; çıplak gözle görülemeyen yapıların büyütülerek gözlenmesini sağlayan ışık kaynağı ve yerleşik mercek yapıları içeren aletlere verilen addır.
Mikroskop Çeşitleri
Işık Mikroskop
Bir ışık mikroskobunda hem mekanik hem de optik kısımlar vardır. Mekanik parçalar; ayarlı tabla, tabladaki tabla konum ayarı ve görüntü netleştirmede rol alan dişli sistemleridir. Optik kısımlar üç mercek sisteminden oluşur. Bunlar kondansatör, objektif ve okülerdir. Kondansatör; incelenen nesneyi aydınlatan bir ışık demeti oluşturacak şekilde ışık kaynağından gelen ışığı toplayarak odaklar, objektif; incelenen nesnenin aydınlatılan görüntüsünü okülere doğru büyüterek yollar, oküler; bu görüntüyü daha da büyüterek gözlemcinin gözüne veya fotoğraf makinasına ya da morfolojik ölçümler için bilgisayar ekranına iletir. 0.2 μm’den daha küçük nesneler bu aletle seçilemezler.
Faz Kontrast Mikroskop
Bu mikroskop ile boyanmamış canlı hücre ve doku kesitlerinin incelenmesine olanak sağlar. Temel ilkesi ışığın farklı kırılmaya sahip hücre ve hücre dışı yapılardan geçerken hız ve yönünü değiştirmesine bağlıdır. Bu değişiklikler yapıların daha açık veya koyu görünmesine neden olur. Özellikle doku kültürü gibi canlı hücresel yapıların gözlenmesinde kullanılırlar.
Polarizasyon (Kutuplaştırma) Mikroskobu
Polarizasyon mikroskobu yüksek düzeyde düzenlenmiş moleküllerden oluşan yapıların tanınmasını sağlar. Kutuplaştırılmış ışığın titreşim yönünü saptırma yeteneğine çift kırma yani anizotropi adı verilir. Kollagen ve kas lifleri gibi anizotropi gösteren yapıların incelenmesinde kullanılır.
Konfokal Mikroskop
Bir objenin ve görüntüsünün aynı odağa sahip olmasına konfokal denir. Konfokal mikroskop floresansla işaretlenmiş, saptanmış ya da canlı hücrelerde yüksek çözünürlük sağlayarak görüntü elde etme ve elde edilen görüntüleri birleştirerek üç boyutlu yapısı hakkında fikir vermektedir.
Floresans Mikroskop
Floresans; maddeler uygun dalga boyundaki ışık alttan tutulduğunda daha uzun dalga boyunda ışık yayarlarsa meydana gelir. Floresans maddeler karanlık bir zemin üzerinde parlak ışıltılı parçacıklar şeklinde izlenir.
Elektron Mikroskop
Temel olarak elektron mikroskoplarda vakum sistemi, elektromanyetik alan ve kolon olmak üzere üç ana bölüm bulunmaktadır.
Geçirimli elektron mikroskobu (TEM); Yüksek çözümleme gücüne sahiptir. Bu çözümleme gücü görüntülenen yapının ayrıntılarını 400.000 kez büyüterek iki boyutlu görülebilmesini sağlar.
Taramalı elektron mikroskobu (SEM); Hücrelerin, dokuların ve organların yüzeyine ait üç boyutlu görüntüler oluşturur. TEM’den farklı olarak elektronlar örneğin içinden geçmez.