LBV207U-TEMEL VETERİNER PATOLOJİ
Ünite 2: Örnek Alma ve Mikroskobik İnceleme Süreci
Giriş
Organizmadan alınan organ ve doku örneklerinin mikroskopta incelenecek hale gelinceye kadar geçen işlemlerin tümü “histolojik teknikler” olarak tanımlanmaktadır. Histolojik teknikler de kendi içerisinde örnek alma ve makroskobik değerlendirme, tespit, yıkama, dehidrasyon, saydamlaştırma, emdirme, gömme-bloklama, kesit alma ve boyama gibi alt kısımlara ayrılır.
Canlı Örnek İncelemeleri
Canlı dokular hızlı bir şekilde bozuldukları için kısa süre içerisinde incelenmesi gerekmektedir. Canlı inceleme ya doğrudan faz kontrast mikroskop ya da vital veya supravital boyalar kullanarak ışık mikroskop ile yapılır.
Cansız Örnek İncelemeler
Cansız doku, sıvı ve içeriklerin incelenmesi fiziksel (kaynatma, kurutma, dondurma) ve kimyasal (alkol, civa, formalin) olarak tespit edilmiş ve boyanmış doku kesitleri üzerinde ya da dışkı gibi boyanmamış preparatlarda direkt olarak ışık mikroskopla yapılmaktadır.
Örnek Alma ve Makroskobik Değerlendirme
Nekropsi: Hayvanların neden öldüğünü ortaya koymak ya da deneysel amaçla öldürülen hayvanlardaki bulguları saptamak amacıyla ölüm sonrası yapılan incelemeye denir.
Otoliz
Ölümden sonra doku ve hücrelerin enzimatik olarak yıkıma uğrayıp kendi kendini eritip sindirmesine otoliz denir. Otoliz ilerledikçe bağırsaklar kolayca yırtılır, içerik bulamaç kıvamını alır. Karaciğer ve böbrek gibi organlar parmakla basıldığında parçalanır.
İskemi: Kan dolaşımının durması sonucu kan akımının olmaması durumuna denir.
Örnek Alma
Salgın bir hastalık söz konusu ise uzman, sistematik olarak tüm organ ve dokulardan laboratuvar incelemeleri için örnek toplamalıdır. Farklı laboratuvar incelemeleri için alınacak örnekler de farklı saklama yöntemlerine göre alınarak ilgili laboratuvara gönderilmelidir. Bu inceleme yöntemlerini şu şekilde sıralayabiliriz;
Mikrobiyolojik İncelemeler; bu amaçla alınan örnekler steril ve olabildiğince yıpratılmadan taze bir şekilde plastik kutu veya naylon torba içerisine soğuk zincirde laboratuara ulaştırılmalıdır.
Parazitolojik İncelemeler; Paraziter hastalıkların kesin tanısı için bunların parazitolog tarafından belirlenmesi gereklidir. Uygun koşullarda bu belirleme taze olarak toplanmış parazitler üzerinde yapılmalıdır.
Kimyasal ve Toksikolojik İncelemeler; Zehirlenmelerin hangi kimyasala ait olduğunun saptanması gerekir. Bu amaçla alınacak örnekler şüphelenilen zehire göre olmalıdır. Genellikle karaciğer, böbrek, mide ve bağırsak içerikleri büyük hacimlerde laboratuara gönderilir.
Histopatolojik İncelemeler; nekropsi sonrasında histopatolojik incelemeler için alınacak organ ve doku örnekleri şüphelenilen hastalığa göre değişmektedir. Eğer belirli şüphelenilen hastalık bulunmuyorsa lezyonlu olanlardan veya sistematik olarak tüm organ ve dokulardan örnek alınır. Örnek almada kullanılan bıçak, bisturi ve makas gibi kesici aletler keskin olmalıdır.
Sitopatolojik İncelemeler; erken tanı ve etkin sağaltım için vücut sıvılarından (kan, vagina, mukus, idrar, tükürük) palpe edilebilir kitlelerden ince iğne aspirasyonu ile örnekler alınır.
Elektron Mikroskobik İncelemeler; deneysel çalışmalarda elektron mikroskobik düzeydeki değişiklikleri veya saha çalışmalarında etkenleri (bakteri virus, protozoon) saptamak için doku örnekleri alınır. Bu amaça alınan örnekler 0.5-1mm3 gibi küçük boyutlarda olmalıdır.
Lezyon: Dokunun sınırlı patolojik ve/veya travmatik olarak bütünlüğünün ve fonksiyonunun bozulmasına denir.
Palpasyon: Dokunma duyusundan yararlanılarak elle yapılan muayeneye denir.
Süspansiyon: İçerisinde dokuya ait parçacıkların bulunduğu sıvıya denir.
Grid: Elektron mikroskobik incelemelerde histolojik incelemelerdeki lamın karşılığıdır.
Makroskobik Değerlendirme
Nekropsi sonrası veya farklı kliniklerden biyopsi materyali olarak gönderilen organ ve doku örneklerinin makroskobik olarak çıplak gözle değerlendirilmesi ve mikroskobik inceleme için alanlar belirlenmesi makroskobi odası olarak tanımlanan aydınlık ve iyi havalandırılmış bir odada yapılır.
Trimleme: Mikroskobik kesitler için organ ve dokuları keserek küçültme işlemine denir.
Tespit (Fikzasyon)
Fikzasyon işlemi fiziksel ve kimyasal yollarla yapılabilir. Dondurma ile tespit, hücresel yapıların histolojik değerlendirmesi çok düzgün olmamakla birlikte hızlı tanıda kullanılır. Kimyasal tespit ise en çok kullanılan yöntemdir.
Kimyasal tespit solüsyonları;
1. Aldehitler (formaldehit, glutaraldehit, glioksal) Okside Ediciler (osmium tetroksit, potasyum permanganat, potasyum dikro. 2. Protein Yıkımlayanlar ve Pıhtılaştıranlar (asetik asit, metil alkol, etil alkol) 3. Diğer Çapraz Bağ Oluşturanlar (karbodiimidler) 4. Diğer (civa klorid, pikrik asit, aldehit içermeyenler) olmak üzere sınflandırılırlar.
Tespit Solüsyonunun Amaca Göre Seçimi
Doku ve hücrelerin canlı hayattaki yapılarına en uygun şekilde tespit birinci derecede osmium tetroksit, ikinci derecede de ise formalinle olduğunu unutmamak gerekir.
Bu iki tespit solüsyonunun proteinlerin yapısını bozmadan çok az bir çökelmeye neden olması iyi bir koruyucu nitelik taşıdığının göstergesidir.
Tespit Solüsyonunun Miktarı
Bir tespit solüsyonuna gereğinden fazla örnek konursa solüsyon içerisindeki kimyasallar yetersiz kalır ve uygun bir tespit oluşmaz. Bunun için 1:50-1:100 oranı bildirilmektedir, ancak 1:15-1:25 oranı ile de uygun sonuç alınabileceğini belirtmek gerekir. Buna uymayan osmium tetroksitin %1-2’lik solüsyonu için oran 1:5’dir.
Doku örneklerinin tespit solüsyonu içerisinde bulundurulma süresini etkileyen çeşitli faktörler vardır. Bunlar:
• Örneğin büyüklüğü • Tespit solüsyonunun derine inme (difüzyon) gücü • Ortamın ısısı • Amaç • Doku örneğinin yapısı
Tespit Uygulama Teknikleri
Tespit işleminde immersiyon (daldırma) ve perfüzyon (basınçla uygulama) olmak üzere iki yol kullanılır. En Çok Kullanılan Tespit Solüsyonları şunlardır:
• Aseton • Etil alkol • Asetik asit • Formalin
Birkaç Kimyasal İçeren ve Çok Kullanılan Tespit Solüsyonları
• Nötral Buffer Formalin: (%37-40 formaldehit 100 ml + distile su 900 ml +sodyum dihidrojen fosfat monohidrat 4 gr + disodyum hidrojen fosfat anhidroz 6.5 gr) • Carnoy’un Tespit Solüsyonu: (Saf etil alkol 60 ml + kloroform 30 ml + glasial asetik asit 10 ml);. - Bouin’in Tespit Solüsyonu: (pikrik asitin suda doymuş solüsyonu 75 ml + %40 formaldehit 25 ml + glasial asetik asit 5ml) • Zenker’in Tespit Solüsyonu: (distile su 100 ml + potasyum dikromat 2.5 gr + civa klorür 4-5 gr +glasial asetik asit 5 ml sodyum sülfat 1 gr)
Sitopatolojide Tespit
Hazırlanan yayma ve tuşe preparatlarda tespit ıslak ya da kuru olabilir. Islak tespit için hazırlanan preparat, çoğunlukla %96’lık etil alkolde 10 dakika bırakılarak yapılır.
Elektron Mikroskopide Tespit
Tespit sıvısı olarak birinci tespitte en çok stok solüsyonundan hazırlanmış %2.5’luk buffer glutaraldehit (% 25 glutaraldehit stok solüsyon 10 ml + 0.1 mol/L kakodilat buffer pH: 7.4) ikinci tespitte ise sulu % 2’lik osmium tetroksit (osmium tetroksit 1.0 gr + distile/deiyonize su 50 ml) kullanılır.
Dekalsifikasyon (Kalsiyumsuzlaştırma)
İlk olarak bu sert dokular içerisinde bulunan kalsiyumun uzaklaştırılarak dokunun yumuşatılması gerekir. Bu işleme ise dekalsifikasyon (kalsiyum uzaklaştırma, kalsiyumsuzlaştırma) denir.
Doku İşlenmesi Süreci
Doku işlenmesi; makroskobik olarak saptanan lezyonlu ya da normal organ ve doku örneklerinin mikrotomla kesilebilmesi için yapılır. Tespitten sonra yapılan bu işlem yıkama, dehidrasyon (suyunu giderme), saydamlaştırma (alkolü giderme) ve emdirme gibi kısımları kapsar.
Otomatik Doku İşlenmesi
Günümüzde yarı kapalı vakumlu/vakumsuz dönerli (karosel) veya kapalı pompalı dolap tipi olmak üzere iki tip doku işleme aleti bulunmaktadır. Doku işleme aletinde doku örneklerinin yıkama sonrası yapılan dehidrasyon, saydamlaştırma ve emdirme işlemleri otomatik olarak yapılmaktadır.
Elektron Mikroskopide Doku İşlenmesi
Tespit edilen doku örnekleri tamponla yıkanır dereceli alkollerden (%70, 90, 95, 100 saf alkol) geçirilerek tamamen dehidrasyonu yapılır, propilen oksitte saydamlaştırılır ve epon veya araldite emdirilerek kapsül şeklinde veya lastik/plastik kalıplarda bloklanır. Daha sonra etüvde blok materyaline göre değişen derecedeki ısılarda sertleştirilir.
Parafine Gömme (Bloklama)
Emdirme materyalini iyice emmiş olan doku örnekleri yine aynı materyal içerisine gömülür. Bu amaçla özel kalıplar içerisine emdirme materyali doldurulur. Günümüzde neredeyse tüm patoloji laboratuarlarında gömme aleti (Resim 2.4) bulunmaktadır. Bu alette parafini sıvı halde tutan hazne, gömmenin yapıldığı parafinin donmasını önleyen sıcak tabla ve blokları sertleştirmek için soğuk tabladan oluşur.
Desikatör: Nemsiz ortam sağlayan cam kaplara denir.
Kesit Alma
Parafine gömülerek homojen bir biçimde sertleşmiş olan blok, mikrotom adı verilen aletle kesilir. Kızaklı (Resim 2.5a) ve rotary (Resim 2.5b) mikrotom tipleri en yaygın kullanılanlarıdır. Bu aletlerde kullanılan bıçaklar günümüzde belirli süre kullanılıp atılır.
Dondurma Kesiti Alma
Cerrahi uygulamalar sırasında, deneysel çalışmalarda ötanazi uygulanmadan hemen önce veya agoni durumundaki hayvanlardan alınan doku örneklerinden kriostat adı verilen aletle dondurma kesiti alınır. Bu tip kesit alma; hızlı sonuç istenen olgularda, immunohistokimyasal (immunofloresan ve bazı immunohistokimyasal) çalışmalarda, enzim çalışmalarında ve özellikle rutin doku işlenmesi esnasında kaybolan lipid ile bazı karbonhidratların saptanmasında kullanılır.
Ötanazi: Canlıyı acı vermeden öldürmeye ötanazi (euthanasie) denir. Bu durumda ötanazi, kolay ve rahat ölüm anlamına gelmektedir.
Agoni: Ölüm öncesi dolaşımın zayıflaması sonu beynin kansız kalmasıyla şekillenen can çekişme haline denir.