LBV210U-LABORATUVAR HAYVANLARI YETİŞTİRME VE
SAĞLIĞI
Ünite 7: Genetiği Değiştirilmiş Deney Hayvanlarının
Yetiştiriciliği ve Sağlığı
Giriş
Gen, canlı bireylerin kalıtsal özelliklerini taşıyan, ortaya çıkaran ve nesilden nesile aktaran kalıtım faktörleri olup, DNA zinciri üzerindeki işlevsel en küçük yapısal birimdir. Genetik kodu (DNA’sı) insan yapımı değişiklikleri içeren deney hayvanlarına “genetiği değiştirilmiş deney hayvanları” denir. Eğer bu değişiklikler yabancı bir genin eklenmesini içeriyorsa, bu hayvanlar “transgenik hayvan” olarak adlandırılır. Mevcut bir genin hedeflenip mutasyona uğratılması, yani aktivitesinin değiştirilmesi durumunda, bu hayvanlar knock-out (nakavt) ya da knock-in (nakin) deney hayvanı olarak bilinir. Tüm bu hayvan grupları, başka bir organizma veya türe ait bir geni kendi genomlarına entegre ederler ve bu sayede normal genetik aktivitenin ötesinde yeni bir aktivite sergilerler. Bu genetik değişiklikler, genetiği değiştirilmiş hayvanlarda (fareler ve sıçanlar) yeni genotipik ve bazen fenotipik özelliklerin ortaya çıkmasına neden olmaktadır ve bu değişikliklerin yavrulara da aktarılması, yani nesiller boyunca devam etmesi gerekmektedir. Bu ünitede, en sık kullanılan genetiği değiştirilmiş hayvan platformu olduğu için fareler örnek olarak ele alınacaktır ancak bu prensipler diğer genetiği değiştirilmiş deney hayvanları için de uygulanabilmektedir. Yapılan çalışmalarda hayvan deneylerinin amacı; hücre, doku, organ ve sistem seviyelerinde fizyolojik ve patolojik mekanizmaları anlamak, sistemler arası etkileşimleri ortaya çıkarmak, hastalıklara (özellikle Parkinson, Alzheimer, Amiyotrofik Lateral Skleroz, DMD, otizm, şizofreni, multipl skleroz, kistik fibroz, böbrek yetmezliği, diyabet, kanser, romatizma, astım, hipertansiyon gibi hastalıklar) karşı yeni teşhis yöntemleri bulmaktır. Günümüz teknolojisinin gelişmesiyle birlikte daha kesin, etkili ve amaca yönelik sonuçlar sağlayan farklı genetik modeller tercih edilmekte olup bu amaçla kullanılan hayvanlar “genetiği değiştirilmiş deney hayvanları” olarak adlandırılmaktadır. Genetiği Değiştirilmiş Deney Hayvanları
Genetiği değiştirilmiş deney hayvanları, elde ediliş biçimlerine göre: transgenik deney hayvanları ve hedeflenmiş mutasyona sahip (nakavt/knock-out ve knock- in/nakin) hayvanlar olarak iki kategoride incelenmektedir.
Transgenik Deney Hayvanları
Bu hayvanlar, başka bir organizmadan elde edilen haberci (messenger) RNA tamamlayıcı kopyasının uygun teknikler kullanılarak hedef hayvanın hücrelerine aktarılması ile oluşturulurlar. Bu amaçla birçok teknikten yararlanılmaktadır;
• Viral Vektörlerle Gen Transferi • Embriyonal Kök Hücrelere Gen Transferi • Spermatozooitlere Gen Transferi • Testislere Gen Transferi • Nükleer Transfer Teknolojisi • Pronükleer-DNA Mikroenjeksiyonu
Hangi teknik kullanılırsa kullanılsın, asıl amaç farklı bir gen bölgesini pronükleus hâlinde zigota aktararak canlı bir transgenik organizma elde etmektir. İşlem görmüş yumurtalar, dişi hayvanın uterusuna veya oviduktuna cerrahi yöntemle yerleştirilebileceği gibi, uygun koşullar altında uzun süreler saklanmak üzere dondurulabilir. Örneğin; Pronüklear-DNA mikroenjeksiyon tekniği ile transgenik fare elde edilmesi basamaklar hâlinde kitabın 161. sayfasındaki Şekil 7.1 de gösterilmektedir.
Transgenik canlı üretiminde doğan yavrunun sahip olduğu yeni genetik özelliklerin, kendi yavrularına hatta sonraki nesillere aktarılması gereklidir. Bunu gerçekleştiren fareler “kurucu” olarak adlandırılır. Öte yandan, her jenerasyon genetik özellik olarak atalarının özelliklerini gösterse de fenotipik olarak istenilen genetik özellikleri yansıtmayabilir. Bu duruma ise “gen susması” denir ve ilerleyen bölümlerde daha ayrıntılı ele alınacaktır.
Hedeflenmiş Mutasyona Sahip Deney Hayvanları
Knockin ve knockout kavramlarından bahsetmek gerekirse hedef genin susturulması işlemine “Knockout” (Okunuşu: Nakavt), normalde suskun olan bir genin aktive edilmesi işlemine de “Knockin” (Okunuşu: Nakin) denir. Nakavt ve nakin hayvanlar böylelikle daha önce göstermedikleri bir genetik özelliği göstermeye başlarlar ve amaca göre bir deneysel model oluşturulmuş olur. Bunun için yaygın olarak embriyonal kök hücre yöntemi kullanılmaktadır. Burada genetik özellikleri çok iyi bilinen fare ya da sıçan kullanılır.
Bu modelin oluşturulmasında ilk olarak farelerin embriyonal kök hücreleri izole edilip saklanmalıdır. Ardından, hedef gen bölgesinin mutasyonlu (değiştirilmiş) bir şekli eldeki kök hücrelere elektroporasyon ya da mikro- enjeksiyon gibi tekniklerle aktarılmaktadır. Aktarımın başarılı gerçekleştiği kök hücreler seçilerek normal bir embriyoya aktarılır. Tüm prosedür bu embriyonun aynı türden taşıyıcı bir gene aktarılmasıyla son bulmaktadır. Devamında doğacak yavruda hem mutasyonlu hem de mutasyonsuz hücreler birlikte bulunacaktır. Bu şekildeki hayvan “kimerik hayvan” adını almaktadır.
Kitabın 163. sayfasındaki Şekil 7.2’de ise “Nakavt/Nakin fare elde etmeye ait aşamalar” açıklanmaktadır. Kök hücre donörü olarak 129/SV kodlu soyu zigot donörü olarak da C57BL/6 kodlu soyu fareler en sık kullanılanlardır.
Genetiği Değiştirilmiş Deney Hayvanlarıyla İlgili Özel Durumlar
Genetiği değiştirilmiş deney hayvanlarının kolonileştirilmeleri, dolayısıyla da çoğaltılmaları noktasında kesinlikle uzman kişiler görevlendirilmelidir. Çünkü çoğaltım sırasında elde edilen yavruların genetik özelliklerinin takibi ve gerçekleştirilmesi gereken deneye uyumluluğunun sorgulanmasının yanında koloninin
devamlılığı için uygun tekniklerle seçim ve planlama yapılması gerekmektedir.
Genotiplendirme
Genotiplendirme, bir organizmanın genetik yapısını belirlemek veya analiz etmek için yapılan bir dizi teknik ve yöntemi ifade etmektedir. Burada, genetiği değiştirilmiş bir türden elde edilen yavrulardan elde edilen biyopsi dokularında genetik yöntemler kullanılarak genetik özelliklerinin istenilen yapıda olup olmadığının incelenmesi söz konusudur.
Genotiplendirme yöntemleri arasında PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu), DNA mikrodizisi, DNA dizileme ve genetik işaretleyicilerin kullanımı gibi teknikler bulunur. PCR için hayvanın kuyruk, kulak, kan, kıl, dışkı ya da başka bölgelerinden alınan biyopsi dokularında veya örneklerinde genetik özellikleri (DNA) araştırılır. PCR yöntemi ve DNA incelemesinin temel nedeni çok küçük numunelerle çok iyi sonuçların alınabilmesidir. DNA analizi gerçekleştirmek için kuyruktan alınan doku örneklerinin kullanılması güvenilirliği, etkinliği ve insani olması bakımından en sık kullanılan yöntemdir.
Kemirgenlerde ağrı duyusu bazı vücut bölümleri için doğumdan bir müddet sonra gelişir ve bu kuyruk için yaklaşık 12-14 gündür. Bu nedenle doğduktan sonra 12-14 güne kadar kuyruktan makasla alınan biyopsi örnekleri ağrı bağlamında hayvanlar tarafından tolere edilebilir bir durumdur. Eğer yetişkin bir fareden kuyruk biyopsisi alınacak ise bu durum sadece az ve geçici bir sıkıntıya neden olacak ve ani strese bağlı fizyolojik değişimler dışında önemli bir sorun teşkil etmeyecektir.
Araştırmacılar yine de kıl, dışkı ya da oral numuneler gibi invazif ya da cerrahi olmayan yöntemlere yönlendirilseler de en sık kullanılan ve etkin yöntem kuyruk biyopsisidir.
Genetiği Değiştirilmiş Hayvan Modelinin Hastalık Profili
Genetiği değiştirilmiş hayvanların bazıları kendiliğinden gelişecek şekilde bir hastalık profili sergilerken, bazıları ise yalnızca hedef hastalık patolojisinin bazı semptomlarını sergileyebileceği için öncelikle hayvanın normal yaşamı süresince ya da deneysel kullanım süresince gerçekleşebilecek hastalık/hastalıklarının profilini belirlemek çok önemlidir. Bunun yanında hayvanların sağlığını yakından izlemek ve belgelemek de gereklidir.
Genetiği değiştirilmiş bir tür, bir merkez veya laboratuvarda koloni oluşturulmadan önce, o türün özellikleri ve fenotipi hakkında kapsamlı bir kaynak araştırması yapmak, koloninin sağlıklı bir şekilde devamlılığını sağlamak için gereklidir. Bu amaçla çeşitli protokoller, birçok ülkede yetkili deney hayvanı refahı ile ilgili kurumlar tarafından özellikle talep edilmektedir.
Üretim İçin Kullanılacak Hayvan Sayısının Belirlenmesi
Genetiği değiştirilmiş bir hayvan geliştirmek için ilgili etik komiteye başvurulurken kullanılacak tahmini hayvan
sayısını belirtirken, öngörülen/öngörülmeyen sonuçları ve belirsizlikleri dikkate almak gerekir.
Koloniyi kurmak için belirlenen kurucu fare sayısının ardından, soyun sürdürülmesi ve karakterize edilmesi için genellikle 80-100 fareye ihtiyaç duyulabilir. Bu hayvan sayısına ulaşabilmek için yaklaşık 5 çift sağlıklı damızlık hayvanın kullanılması genellikle yeterli olacaktır. Ancak, bazı heterozigot soyların geliştirilmesi için daha fazla hayvana ihtiyaç duyulmaktadır.
Damızlık bir koloninin oluşturulması için genellikle fazla sayıda hayvana ihtiyaç duyulur ve hangi damızlıklardan kaç yavru elde edileceği önceden tahmin edilemez. Çünkü doğacak yavruların sayısını ve cinsiyetini tam olarak bilmek mümkün olamamaktadır. Ayrıca, damızlıklardan elde edilen yavruların eksik olabileceği ve hedeflenen genotip veya cinsiyete sahip olmayabileceği de düşünülmelidir. Bu amaçla, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı veya ilgili resmî kurumlar, genç hayvanların tahmini sayısını planlama sürecine dahil etmek için pratik rehberler geliştirmelidir.
Araştırmacılar, deneyde kullanılacak tüm sütten kesilmemiş hayvanlar hakkında bilgi vermek veya Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı gibi ilgili resmî kurumları bilgilendirmek için hayvan sayılarını şu şekilde verirler:
Deneysel işleme tabi tutulacak sütten kesilmiş ve yetişkin tahmini hayvan sayısı -----*
Deneysel işleme tabi tutulacak sütten kesilmemiş tahmini hayvan sayısı -----*
TOPLAM SAYI -----
Damızlık olarak tutulan ve deneyde kullanılmayacak tahmini hayvan sayısı -----
Sütten kesilmeden önce/sonra itlaf edilecek ve deneyde kullanılmayacak tahmini hayvan sayısı -----
*Tahmini rakamlar, kurumsal ölçütlere göre işlemlerin invazivliği temelinde alt bölümlere ayrılmalıdır.
Eğer 1-2 haftalık yavruların kullanıldığı bir deney için gerekli damızlık sayısı tahmin edilecekse, kitabın 168. sayfasındaki 1. numara ile gösterilen formül kullanılmalıdır.
a. Cinsiyet düzeltmesi: Eğer deney için sadece belirli bir cinsiyet (yalnızca erkek veya yalnızca dişi) gerekiyorsa bu faktör kullanılır.
Her iki cinsiyette kullanılacak ise: Çarpan→1
Yalnızca dişiler kullanılacak ise: Çarpan→ 0.5*
Yalnızca erkekler kullanılacak ise: Çarpan→ 0.5*
*Çarpan, yavruda 50:50 dişi-erkek cinsiyet oranını varsayar. Kullanılan türe özel alışılmadık bir cinsiyet oranı önceden biliniyorsa, çarpan buna göre değiştirilir.
b.Mutant düzeltmesi: Belirli bir genotipe sahip yavrular gerekiyorsa bu faktör kullanılır. Deneyde kullanılacak yavruların sadece belirli bir genotipe sahip olması gerekiyorsa istenilen genotipe göre uygun bir çarpan kitabın 168. sayfasındaki Tablo 7.2’den yararlanılarak belirlenir.
c.İnfertilite faktörü: İnfertilite için kullanılan bir düzeltme sayısıdır. Bu faktör, kullanılan türe bağlı olarak değişkenlik gösterebilir. İnfertil çiftleşmelerin oranı, kullanılan tür hakkında detaylı bilgi edinildiğinde belirlenir ve oran belirlendikten sonra uygun bir faktör kitabın 169. sayfasındaki Tablo 7.3’den yararlanılarak belirlenir.
Genetiği Değiştirilmiş Hayvanların Refahı ve Davranışlarının Değerlendirmesi
Bu bölümde genetiği değiştirilmiş hayvanlarda refah ve davranışlarının değerlendirilmesine ait önemli bilgiler ele alınacaktır.
Genetiği Değiştirilmiş Hayvanların Refahı
Genetiği değiştirilmiş hayvanlarda sindirim sorunlarına özellikle dikkat edilmelidir. Mutant hayvanlarda sindirim sorunları ve knockout farelerde idrar problemleri meydana gelebilmektedir. Bu nedenle, bu hayvanların kafeslerine daha fazla altlık konmalı ve kafes temizliği daha sık yapılmalıdır.
Eğer hayvanlar sesten etkileniyorsa kafeslerin yer aldığı ortamda tamamen ses yalıtımı sağlanmalıdır. Bu tür hayvanların bakım personeli tarafından düzenli ve dikkatli bir şekilde refahının sağlanması önemlidir. Ayrıca, aynı personel genellikle hayvanlardaki sakatlık ve anormallikleri veya farklılıkları ayırt edebilme konusunda da eğitimli olmalıdır.
Fazla sayıda genetiği değiştirilmiş deney hayvanının bulundurulması nedeniyle hayvanların fizyolojik dengelerinin ve davranışlarının olumsuz etkilenmesini önlemek için günümüzde birçok kuruluş bireysel olarak havalandırılan kafes sistemleri (Individually Ventilated Caging: IVC) kullanmaktadır. Her bir kafeste ayrı bir hava dolaşımı olduğu için hayvanların sistematik olarak takip edilmesi, kolay bakılması ve daha sağlıklı bir ortamda barındırılması mümkün olmaktadır.
Genel Sağlık Değerlendirmesi
Hayvanlardaki gizli sağlık sorunları, öğrenme kabiliyeti, hafıza, saldırganlık, çiftleşme ve ebeveynlik gibi daha karmaşık davranışların değerlendirilmesinde hatalara sebep olabilir. Bu nedenle davranış değerlendirmesi öncesinde potansiyel sağlık sorunlarının belirlenerek uygun bakım koşullarının sağlanması hayati önem taşımaktadır.
Fareler için genel sağlık değerlendirmesinde; vücut ağırlığı, vücut sıcaklığı ve kürkün görünümünün dikkate alınmasının ardından nörolojik refleksler, uzuvların hareketi, göz kırpma ve dokunsal uyarılara yanıt olarak
kulak ve bıyıkların hareketi gibi unsurlar göz önünde bulundurulmalıdır.
Aşağıdaki belirtilerden herhangi biri gözlendiğinde tedavinin uygulanması ve akabinde davranış fenotiplemesinin yapılması gerekir:
• Hareketsizlik
• Uyuşukluk
• Tüylerde dikleşme ve sertleşme
• Korunma pozisyonunda durma
• Saldırgan duruş
• Kendi kendine zarar verme
• Hafif uyarılara yanıt vermemek
• Alışılmadık sesler çıkarma (Ağrılı uyarılara karşı/uyaran olmadan)
• Artmış kalp ve solunum hızı
• 24 saatten uzun iştahsızlık
• %20’den fazla kilo kaybı
• Yaşıtlarına göre kilo alamama
• Şişlik, kızarıklık gibi fiziksel değişiklikler
Ayrıca, hayvanlarda yiyecek, uyku, hareket, çiğneme ve yutkunma gibi davranışların gözlenmesi ve kafeslerin genel durumunun takibi gerekir.
Genetiği Değiştirilmiş Hayvanların Davranışlarının Değerlendirmesi
Genetiği değiştirilmiş hayvanların davranışlarının incelenmesinde, refah gibi önemli konularda olduğu gibi mevcut modele bağlı olarak farklılıklar olacağı dikkate alınmalıdır. Bunun yanında duyusal ve motor becerilerini içeren testler yapılmalıdır. Davranışsal değerlendirme çalışmaları, yeterli sayıda transgenik hayvanın bulunduğu bir kolonide, hayvanların refahını olumsuz etkileyebilecek duyusal, motor veya motivasyon eksikliklerini belirlemek için titizlikle başlatılmalıdır.
Genel Değerlendirmeler
Genetiği değiştirilmiş hayvanlarda duyusal ve motor testler karmaşık davranışların incelenmesine başlamadan önce yapılmalıdır. Ayrıca, bakım personeli tarafından dikkatlice gözlemlendiğinde belirgin bir davranış fenotipine sahip olmayan mutantlar arasında bile keşfedilmemiş daha belirgin davranış değişikliklerine sahip knockout fareler olabilirler. Bu tür başlangıçta belirgin olmayan davranışlar genellikle hayvanların uygun doğal ortamlara yerleştirildiğinde zamanla fark edilebilir.
Knockout farelerden gelen davranışsal verilerin yorumlanmasında, bir gen eksikliğinin biyolojik olarak telafi edici mekanizmaları etkinleştirebileceği de unutulmamalıdır.
Duyusal Testler kullanım protokolünde insani bir sonlandırma bilgileri içeren yazılı bir Görme yeteneği için yararlanılan testler arasında görsel kuruma sunması gereklidir. yerleştirme testi ve görsel uçurum testi bulunmaktadır. İşitsel yetenekler ise bir tıkırtı-uyum testi veya akustik Diğer taraftan, m ürkme testi gibi yöntemlerle değerlendirilebilir. Koku alma noktaları, hayvanın yiyecek ve suya erişebilme yeteneği, yeteneğini ise aşırı kokulu yiyecekleri keşfetme süresi veya çevresel uyarılara tepkisi ve genel sağlık durumu koku ayrım testleri ile belirlemek mümkündür. faktörlere dayandırılmalıdır. Aşırı zayıflık, ilerleyici kaybı, üreme Ağrı duyarlılığında, sıcak plakadan pati çekme veya kuyruk kayıplar gibi durumlar örnek olarak çekme testi gibi yöntemler kullanılmaktadır. Bu tür ağrı/acı testlerinden önce transgenik farelerde doku hasarını Son olarak, genetik olarak değiştirilmiş ha önlemek için maksimum ağrı eşiği yerine yavaş tepkiden yaşamları kaynaklanan ağrı eşiğinin belirlenmesi ve testin belirlenen alınmalıdır. Bu noktalar, deneysel prosedürlerin yanı sıra eşiğe ulaşılmadan önce durdurulması uygun olacaktır. genetik değişikliklerin potansiyel etkileriyle büyük önem taşır. Bu nedenle tüm bu konulara dikkat Motor Testler edilmeli ve koloninin Duyusal yetenek testlerinin ardından birçok transgenik özen gösterilmelidir. farede, koordinasyon, çiftleşme ve lokomosyon gibi aktiviteleri etkileyen bozuklukların belirlenmesi çok önemlidir. Bunların değerlendirilmesinde en yaygın testler, hayvanın keşfetme ve araştırma kapasitesine dayalı testlerdir. Açık alan testi bu tür testlerden biri olup bu tür hayvanlara kolayca uygulanabilen bir testtir.
Anksiyete (Kaygı) Değerlendirmesi
Genetiği değiştirilmiş hayvanlar normal hayvanlardan farklı duygusal tepkiler (korku, kaygı, savunma tepkileri gibi) sergileyebildikleri için bunlara ait testlerin de yapılması gerekir. Örneğin; hayvanlarda düşük anksiyete durumu, açık ve aydınlatılmış bir alanda arama/keşif isteği olarak değerlendirilirken, yüksek anksiyete durumuna sahip farelerin muhafaza duvarına yakın durma eğilimleri gözlemlenebilmektedir. Bunun yanında dışkılama da anksiyete seviyelerinin belirlenmesinde test edilmesi gereken önemli bir parametredir.
Hayvan Bakımı ve Kullanımı ile İlgili Diğer Hususlar
Araştırmacı ve bakıcıların, genetiği değiştirilmiş hayvanların genel sorunlarını anlayıp yeterli bilgiye sahip olması gerekir. Duyusal ve motor sorunların yanı sıra diğer zayıflıklar nedeniyle bu hayvanların eksiklikleri anlaşılıncaya kadar tüm bakım personeli tarafından günde en az bir kez gözlem yapılmalıdır.
Ele alınan sorunlara yönelik önerilen prosedürler, deney hayvanlarının kullanımı ile ilgili etik kurul başvuru formunda detaylı olarak açıklanmalıdır. Belirsiz veya bilinmeyen bir deneysel manipülasyonun sonuçlarına karşı, veteriner hekimler, hayvan bakıcıları ve araştırmacılarla birlikte yerel etik kurulların oluşturularak yeni bir değerlendirme planı çerçevesinde çözümlerin üretilmesi uygun olacaktır.
Ağrı/Acı Verici Durumlar ve Sonlanım Noktaları
Bir araştırmacı, yeni oluşturulmuş ve genetik olarak değiştirilmiş hayvanı ilk kez değerlendirirken klinik anormallikler hakkında ya da oluşturulan modelde anormal morfolojik gelişimler hakkında bilgisi olmadığında
yöntemi gibi metni yetkili bir etik kurula veya
utant hayvanlar için insani sonlandırma
gibi kilo sorunları, kambur duruş veya duyusal verilebilir.
yvanların tüm boyunca sonlandırma noktaları dikkate
ilgili olarak
oluşturulması aşamasından itibaren