LBV114U-GENEL MİKROBİYOLOJİ
Ünite 8: Serolojik ve Moleküler Yöntemler
Giriş
Hastalık etkeni olan mikroorganizmaları doğrudan izole etmek ve üretmek yerine, antijen ve antikorlarını tespit etmek daha kolaydır. Serolojik testlerde; enfeksiyon ajanı olan mikroorganizma antijenleri, bağışıklık yanıtının gösterilmesi için antikorları, akut ve iyileşme aşamalarının takibi hızlı ve güvenilir bir şekilde gösterilebilir. Klinik mikrobiyoloji ve veterinerlikte kullanılan serolojik yöntemler, hayvanların kan serumları kullanılarak antikorların varlığını veya konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan tekniklerdir. Bu teknikler, bir hayvanın bir enfeksiyona veya bir aşıya yanıt olarak antikor üretip üretmediğini, varsa bu antikorların ne kadar süreyle kalıcı olduğunu ve enfeksiyonun veya hastalığın varlığını saptamak için yaygın olarak kullanılır. Serolojik testler, antijen-antikor reaksiyonuna dayanan yöntemlerdir.
Serolojik Yöntemler Ve Sınıflandırılması
Serolojik testleri uygulanma alanına göre, antijen ve antikor testleri olarak ayırmak mümkündür. Antijen testleri, bulaşıcı hastalıkların erken teşhisinde, olası tahmininde veya izole edilen patojenin tanımlanmasında kullanılabilir. Antikor testleri ise; eğer patojen veya patojene ait antijen klasik yöntemlerle tanımlanamıyorsa, farklı hastalıklar açısından donörlerin taranması veya otoimmün hastalıkları teşhis edebilmek için yani bağışıklık tepkisini ölçmek için kullanılabilir. Serolojik testlerde sensitivite ve spesifite denilen iki önemli terim bulunmaktadır. Sensitivite; bir serolojik testin aranan antikorların varlığını saptayabilme yeteneğinin ölçüsüdür. Spesifite ise; bir serolojik testin aranan antikorları (veya gerçek pozitifliği) saptamada ne kadar spesifik olduğunun göstergesidir. Serolojik testler bağlanma fazlarına göre 3’e ayrılmaktadır; birincil, ikincil ve üçüncül bağlanma testleri.
Birincil Bağlanma Testleri
Antijen ve antikorun bağlanması sonucu oluşan kompleksi doğrudan ölçen testlerdir. Ancak bu bağlanmayı gösterebilmek veya görselleştirebilmek için radyoizotoplar, floresan boyalar veya enzimler gibi işaretleyicilere ihtiyaç duyulmaktadır.
ELİZA Testi
ELİZA, viral enfeksiyonların, bakteriyel enfeksiyonların ve paraziter hastalıkların tanısında yaygın olarak kullanılır (Andrade ve ark; 2023). Sıklıkla kullanılan dört tipi bulunmaktadır. 1. Direk ELİZA, 2. Sandiviç ELİZA, 3. İndirek ELİZA, 4. Yarışmalı ELİZA. ELİZA testi ile; kuduz, kedi panlökopenisi, köpek parvovirüsü, kuş gribi, şap gibi viral hastalıklar; Bruselloz, leptospiroz gibi bakteriyel enfeksiyonlar; Toxoplasma gondii, Neospora caninum gibi paraziter hastalıklar teşhis edilebilmektedir.
ELİZA, antikorların veya antijenlerin (proteinlerin) varlığını tespit etmek için kullanılan bir test yöntemidir. Bir antijen veya antikor, özel bir yüzeyde sabitlenir ve daha sonra bir işaretleyici ajan ile işaretlenerek görünür hâle
getirilir. Bu yöntem, birçok enfeksiyöz hastalığın teşhisinde ve aşıların etkinliğinin değerlendirilmesinde kullanılmaktadır.
İmmün Floresan Antikor Tekniği
İmmünofloresans testleri, özellikle hücresel seviyede antijen veya antikorların tespit edilmesinde kullanılan yöntemlerindendir. Bu testlerde, antijenler veya antikorlar floresan boyalarla etiketlenir ve daha sonra incelenen numuneye eklenir. Bu floresan etiketli antikorlar, hedef antijenlere veya antikorlara özgü olarak tasarlanmış olmalıdır. Aynı ELİZA testlerinde olduğu gibi spesifik olmayan bağlanmaları uzaklaştırabilmek için yıkama yapılmalıdır. Direk ve indirek olmak üzere iki şekilde yapılmaktadır.
Radioimmün Tekniği (RIA)
Rekabetçi bir immünolojik testtir. Çok düşük konsantrasyonları ölçmek için radyoaktif olarak etiketlenmiş antijenler kullanarak (veya antikorlar) gerçekleştirilen hassas bir yöntemdir. İşaretleme için; H 3, C 14, S 35, P 30 veya I 125 gibi radyoaktif izotoplar
kullanılabilir. Hormonlar, ilaçlar, enzimler, mikrobiyal antijenler (Hepatit B antijeni), karsinoembriyonik ve α-feto proteini antijenlerinin ve/veya antikorlarının tespiti için de kullanılabilir.
İkincil Bağlanma Testleri
İkincil bağlanma testlerinde, öncelikle birbirine özgül antijen-antikor bağlanması gerçekleşir ve sonrasında gözle görülebilir bir kompleks oluşur.
Aglütinasyon
Aglütinasyon reaksiyonları; antikorların (aglütininler) ve partikül antijenlerin (ör; bakteriler, hücreler veya partiküller) uygun bir sıcaklık ve pH’da elektrolitlerin (NaCI) etkileşimi sonucu oluşan aglütinatlara dayanır. İki veya çok değerlikli antikorların partiküllerle bağlanması sonucu büyük küme antijenler veya agregatlar (kümecikler, topakçıklar) oluşur ve kolaylıkla görülebilir. Test niteliksel veya niceliksel olabilir. Aglütinasyonun bazı çeşitleri şunlardır: 1. Serolojik Aglütinasyon, 2. Lateks Aglütinasyon Testi, 3. Türbidemetrik Aglütinasyon Testi. Aglütinasyon yöntemi lamda, tüpde ve mikroplakalarda olmak üzere üç şekilde uygulanmaktadır. Lamda aglütinasyon; aktif ve pasif olmak üzere ikiye ayrılır.
Hemaglütinasyon Testi ve Hemaglutinasyon İnhibisyon Testi
Hemaglutinasyon, kırmızı kan hücrelerinin bir araya gelerek yapışmasına neden olan bir reaksiyondur ve bu durumu gözlemlemek için kullanılmaktadır. Kan grubu testleri hemaglütinasyon testine bir örnektir. Hastanın eritrositleri, A, B, O kan grubu antikorları ile karşılaştırılır, aglütinasyon olan örnek hastanın kan grubunu belirtmektedir. Hemaglütinasyon inhibisyon testinde ise; antikorlar, virüsün hücreler üzerindeki aglütinasyon (bir araya getirme) yeteneğini engelleyerek virüsün enfekte
etme yeteneğini inhibe eder. Testte, önceden belirlenmiş bir virüs ve kırmızı kan hücreleri kullanılır.
Presipitasyon
Presipitasyon reaksiyonları aselüler yapıların (örneğin; virüsler) çözünür antijenleri ile antikorların uygun sıcaklık ve pH’taki elektrolitlerin (NaCl) varlığındaki etkileşimlere dayanır. Çözünebilen iki reaktan bir araya gelerek çözünmeyen ürün veya çökelti oluşturur.
Çözeltide Presipitasyon: Halka testi ve flokülasyon testleri buna örnektir. Halka testi; özellikle veterinerlikte kullanılan bir presipitasyon yöntemidir ve bruselloz tanısında kullanılır.
Agarda (Jelde) Presipitasyon: Agar veya jel içerisinde gerçekleştirilen çökeltme ‘immünodifüzyon’ olarak bilinir.
Elektrik Alanıyla Agarda Presipitasyon (İmmünodifüzyon): İmmünodifüzyon yöntemleri, antijenlerin veya antikorların varlığını ve konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan tekniklerdir.
Komplement Fiksasyon Testi
Komplement fiksasyonu, hasta serumunda antikor varlığını göstermeye yönelik klasik bir yöntemdir. Komplement fiksasyon testi iki bileşenden oluşur. İlk bileşen, koyun kırmızı kan hücreleri, koyun kırmızı kan hücrelerine karşı üretilen immünoglobulin G gibi kompleman sabitleyici antikor ve eksojen bir kompleman kaynağı (genellikle kobay serumu) kombinasyonunu kullanan bir gösterge sistemidir. Bu elementler optimum koşullarda karıştırıldığında koyun karşıtı antikor, kırmızı kan hücrelerinin yüzeyine bağlanır. Kompleman daha sonra oluşan bu antijen-antikor kompleksine bağlanarak kırmızı kan hücrelerinin parçalanmasına neden olur. İkinci bileşen, tamamlayıcıya ek olarak koyun kırmızı kan hücrelerinin bir süspansiyonuna eklenebilen bir antijen ve hasta serumudur. Komplement fiksasyon yönteminin bu iki bileşeni sırayla test edilir.
Üçüncül Bağlanma Testleri
Üçüncül bağlanma testleri, deney hayvanları, embriyolu yumurta gibi in vivo ortamlarda veya hücre kültürü ortamlarında gerçekleştirilen testlerdir. Burada mikroorganizmaların etkilerine bağlı olarak hayvanlarda hastalık oluşabilir ve/veya ölüme neden olabilir, embriyolu yumurtalar ölebilir ve hücrelerde lizis gerçekleşebilir.
Nötralizasyon Testi (NT)
Nötralizasyon, bir antijen-antikor reaksiyonudur. Bu yöntem, bir virüsün veya toksinin nötralizasyon yeteneğini belirlemek için kullanılır. Virüslerin ve toksinlerin biyolojik etkileri nötrleştirici antikorlar olarak bilinen homolog antikorlar tarafından nötralize edilir. Virüs nötralizasyonu ve toksin nötralizasyon testleri olarak iki gruba ayrılabilir. Nötralize edici antikorlar, patojenin biyolojik etkisini yeterince gösterememesi için antijeni bloke eder veya bozar.
Koruma Testleri
Nötralizasyon testine benzemekle birlikte, uygulamanın sadece canlı ortamda yapılması ile bu testten ayrışmaktadır. Koruma testlerinde amaç, önce deney hayvanlarına koruma özelliği test edilecek olan antiserum verilir, sonrasında patojenik mikroorganizma veya toksin uygulanır.
Moleküler Yöntemler Ve Sınıflandırılması
Moleküler yöntemler; mikrobiyologlara ve veteriner hekimlere hastalıkların teşhisi, epidemiyolojisi, patojenlerin genetik varyasyonlarının analizi, aşıların geliştirilmesi ve etkinliğinin değerlendirilmesi gibi birçok alanda önemli bilgiler sağlar. Bu yöntemler, veteriner tıp araştırmalarının ve uygulamalarının temelini oluşturur.
Polimerize Zincir Reaksiyonu (PZR)
PZR, bir DNA veya RNA parçasının milyonlarca kopyasının hızla üretilmesini sağlayan bir moleküler biyoloji tekniğidir. PZR, temel olarak üç aşamada gerçekleşir: Denatürasyon, primer bağlanma ve primerlerin uzatılması.
Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT- PZR)
RT-PZR, RNA’nın DNA’ya ters transkribe ederek dönüştürülmesi ve ardından bu DNA’nın PZR ile kopyalanmasıyla RNA virüslerinin veya mRNA’nın (messenger RNA) analizinde yaygın olarak kullanılır.
Real-time Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPZR)
Real-time PZR, PZR ürünlerinin amplifikasyonunu gerçek zamanlı olarak izleyen bir tekniktir. Bu yöntem, hastalık etkenlerinin miktarının nicel olarak belirlenmesi için kullanılır. Örneğin; bir enfeksiyonun şiddetini belirlemek veya aşıların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.
Yeni Nesil Sekanslama (Nextgeneration Sequencing) (NGS)
NGS, birçok DNA veya RNA molekülünün belirli bir örnekteki tam genetik dizilimini hızla belirleyen yüksek verimli bir teknolojidir.
Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon (Loop-mediated
Isothermal Amplification) (LAMP)
LAMP, izotermal koşullarda hedef DNA’nın hızlı bir şekilde amplifikasyonunu sağlayan bir yöntemdir. Taşınabilir LAMP cihazları, sahada hızlı teşhis için kullanılabilir ve özellikle veteriner tıp alanında kullanışlıdır. LAMP, DNA’nın izotermal (sabit sıcaklıkta) koşullarda hızlı bir şekilde amplifikasyonunu sağlayan bir moleküler biyoloji yöntemidir.
LAMP yönteminin basamakları şöyledir: Reaksiyonun İlk Aşaması, Çift Zincirli DNA’nın Sentezi, Dairesel DNA Yapısının Genişlemesi, Dairesel DNA Yapısının Katlanması ve Yeni Primer Bağlanması, Spiral DNA’nın Hızlı Amplifikasyonu, Sonuçların Değerlendirilmesi.