LBV114U-Genel Mikrobiyoloji
Bölüm 2: Mikoloji (Mantar Bilimi)
Giriş
Mikrobiyologlar; spor taşıyan, klorofil içermeyen, eşeyli ve eşeysiz üreyebilen ökaryotik organizmaları tanımlamak için “mantar” (Latince: fungus/fungi) terimini kullanmaktadırlar. Mantarları inceleyen bilim insanlarına “mikolog” ve mantarları inceleyen bilim dalına ise “mikoloji” denmektedir. Mantarların neden olduğu hayvan enfeksiyonları “mikoz” olarak adlandırılmaktadır.
Mantarların Özellikleri, Morfolojileri ve Hücresel Yapıları
Mantarlar her yerde yaygın olarak bulunan ve çeşitlilik gösteren, küfler ve mayalar gibi iyi bilinen grupları içeren canlıları temsil etmektedir. Şimdiye kadar mantar türlerinin yaklaşık 100.000 türü tanımlanmış olup tanımlanmayı bekleyen 1,5 milyon kadar tür mevcut olabileceği rapor edilmiştir.
Mantarların Özellikleri
Mantarlar şapkalı mantarlar gibi makroskobik türleri içermekle birlikte çoğu mantar türü mikroskopiktir. Mantarların temel amacı organik maddeleri parçalamak (Saprotrof ) olduğundan genelde toprakta bulunurlar. Saprotrof özelliğe sahip mantarlar toprakta ölü bitki maddelerini parçalar ve mineralizasyonda önemli rol oynarlar. Simbiyont mantar türleri birlikte yaşam formunda, karşılıklı fayda sağlayarak varoluş gösteren türlerdir. Bunun dışında çok sayıda mantar türü patojen özelliktedir. İnsan, hayvan ve bitki patojeni olarak yaşayan türler vardır. Mantarların Morfolojisi
Çoğu mantar (küfler) çok hücrelidir ve eşeysiz sporların üretildiği hif (hifa) adı verilen ipliksi boru şeklinde bir filament ağı oluştururlar. Hifler mantar türlerine bağlı olarak bölmelere ayrılmış ise septat/ septumlu veya bölmesiz tek parça hâlinde ise septumsuz yapıda olabilirler. Septumlu hiflerdeki çapraz duvarlar her hifin ayrı hücrelere bölünmesini sağlamaktadır. Bununla birlikte koenositik olarak adlandırılan bir durum olan çapraz duvarların oluşumu olmadan tekrarlanan nükleer bölünmelerin bir sonucu olarak yüzlerce çekirdek tek hif hücresinin içerisinde oluşabilir. Hifler bir araya gelerek miselyum adı verilen ağ topluluklarını oluştururlar.
Mantar Hücrelerinin Yapısal Özellikleri
Tüm mantarlar ökaryotik hücre yapısında olup gövde, yaprak, çiçek gibi bitkilere özgü yapılara ve özelliklere sahip olmayan, klorofil içermeyen ve bundan dolayı da fotosentez yapamayan organizmalardır. Mantarlar tek hücreli veya çok hücreli olabilirler, en basit şekilde mayalar ve küfler olarak ikiye ayrılırlar. Küre şeklinde tek bir hücreden üreyen mantarlara maya, çok hücreli filamentöz ipliksi borulardan üreyenlere ise küf denmektedir. Genel olarak mantar hücreleri; özelleşmiş hücre duvarı yapısı, sitoplazmik membran, çekirdek-çekirdekçik, mitokondri,
ribozom, golgi aygıtı, lizozom, vakuol ve endoplazmik reti- kulum yapılarına sahiptirler.
Hücre Duvarı: Hücre duvarları oldukça dinamik bir yapıda olup hücre yüzeyini genişletmeye direnç göstermektedir. Mantar hücre duvarlarında hifal uçlar ve maya tomurcukları hücre duvarının belirli bölgelerinden uzanmaktadır. Mantar hücre duvarı, gözenekli, makromoleküler bileşiklerden oluşmaktadır. Mantar hücre duvarları tipik olarak %80-90 oranında polisakkaritten oluşur ve az miktarda da protein, lipid, polifosfat ve inorganik iyonlar duvar matrisini (çimentosunu) oluşturur. Bu oranlar türden türe farklılık göstermektedir.
Hücre Zarı: Sterol sınıfı bir molekül olan ergosterol, man- tar hücre zarının ayırt edici bir bileşenidir. Ergosterol hayvan membranlarında kolesterol ile aynı işlevi görmekte olup membran akışkanlığını ve geçirgenliğini kontrol etmektedir. Mantar hücre zarının çift katmanlı lipit tabakası; çözünen madde taşınmasında, sinyal iletiminde, hücre duvarı sentezinde ve altta yatan hücre iskeleti için çapa görevi gören proteinleri içermektedir. İntegral membran proteinleri lipit çift tabakanın kalıcı sakinleridir. Bunlar, hücre zarından iyon ve moleküllerin taşınmasında işlev gören transmembran proteinleri ve integral monotopik proteinleri içerir.
Hücre Sitoplazması ve Organeller: Hif ve maya hücrelerinin sitoplazması ve sitoplazma içerisindeki tüm yapılar, organeller, hücrenin endomembran sistemini oluşturmaktadır. Organeller, hücrenin büyümesini ve gelişmesini sağlayan yapılardır. Fungal endomembran sistemi içerisinde başlıca mitokondri, çekirdek- çekirdekçik, ribozom, lizozom, endoplazmik retikulum, golgi aygıtı, vakuoller ve veziküller bulunmaktadır. Bu sistem hem sitoplazma içindeki bileşenlerin hareketi hem de biyokimyasal faaliyetler açısından çok dinamiktir. Lizozom, endomembranda bulunan enzim taşıyan organellerdir. Mitokondri, sitoplazma içerisinde oval şekilde, yapısında protein molekülleri ve DNA bulunduran, hücrenin enerji vericisi olarak görev almaktadır. Endoplazmik retikulum, çift tabakalı zarla çevrili, protein sentezinde ve metabolizma için gerekli maddelerin taşınımından görevli organeldir. Mantar hücrelerinde bulunan endoplazmik retikulum üzerinde ribozomlar vardır; bu kısımlara rough (kaba), ribozomların olmadığı kısımlara ise smooth (düz) adı verilmektedir. Ribozomlar, sitoplazma içerisinde çok sayıda bulunan RNA ve proteinleri depo eden organellerdir. Protein sentezinden sorumlu olup fungal hücrelerde 80S (60S+40S) büyüklüğündedirler. “S” olarak gösterilen “Svedberg” büyüklük birimi, maya hücrelerini diğer mikroorganizma hücrelerden kolaylıkla ayırmakta olup moleküler identifikasyon çalışmalarında en önemli ayırt edici özellik olarak kullanılmaktadır. Mantarlardaki golgi aygıtı proteinlerin modifikasyonunda işlev görür. Bu işlevlere hazırlık olarak proteinler golgi’de parçalanır, üçüncül yapılarına katlanırlar. Hücre duvarı polisakkaritleri de
golgi’de üretilir ve ekzositoz yoluyla hücre yüzeyine ulaşır. Vakuoller mantar hiflerindeki en büyük endomembran bölmelerini oluştururlar. Olgun hücrelerde sayıca daha fazla rastlanmakta olup içerilerinde pigment, kristal ve amorf maddeleri bulundururlar. Vakuoller uzama, geri çekilme ve peristaltik şekil değişiklikleri yapabilen oldukça hareketli organellerdir. Veziküller, büyümekte olan hiflerde sayıca daha fazla görülmektedir. Hücre duvarı sentezinde ve lizizinde (yıkımında) görevli enzimleri, organik ve inorganik molekülleri depo ederler. Ökaryot hücrelerin sahip olduğu temel ve en önemli yapısı çekirdek ve çekirdekçiktir.
Mantarların Metabolizması, Fizyolojisi Ve Üreme Özellikleri
Metabolik olarak mantarlar heterotrofik ve biyokimyasal olarak çok yönlüdür hem birincil (örneğin sitrik asit, etanol, gliserol) hem de ikincil (örneğin antibiyotikler [penisilin], ergot alkaloidleri, aflatoksinler) metabolitler üretirler. Bu metabolik faaliyetleri gerçekleştirmek için çok fazla enerjiye ihtiyaç duyarlar. Tüm ökaryotik ve prokaryotik hücrelerde olduğu gibi adenozin trifosfat (ATP) temel enerji maddesidir.
Mantarların Metabolizması ve Fizyolojisi
Mantarların çoğu basit besin maddeleriyle gelişebildikleri hâlde bir kısmının ise üremeleri ve gelişmeleri için inorganik maddelere ve özel büyüme faktörlerine ihtiyaç duymaktadırlar. Mantarların karbon kaynaklarını, karbonhidratlar ve organik asitler oluşturmaktadır. Azot kaynağı için amonyum tuzları, sitratlar, proteinler, pepton, peptid, amino asit, üreden sağlamaktadırlar. Bazı türler de amonyak ve nitratı bu amaç için kullanırlar. Mantarların bazı türleri de gelişim süreçleri için gerekli vitamin veya diğer maddeleri sentezleme yeteneğine sahiptirler. Mantarlar sahip oldukları kitin tabanlı güçlü hücre duvarları sayesinde farklı ve zorlu çevre koşullara kolay adapte olma özelliği gösterirler.
Mantarların Üremesi/Replikasyonu
Mantarlar, eşeyli (nükleer füzyondan önce mayoz bölünme ile) veya eşeysiz (mitoz bölünme ile) olabilen sporların oluşumuyla yani sporulasyon yoluyla ürerler. Her iki formda da üreyen mantar sınıfları vardır. Mantarın eşeyli sporlar üreten formu teleomorf, eşeysiz sporlar üreten formu ise anamorf olarak adlandırılır. Ascomycota, Basidiomycota, Glomeromycota ve Microspora mantarları hem eşeyli hem de eşeysiz sporlar üretebilirler. Sporların içerisinde mantar oluşumu için gerekli organik ve inorganik maddeler, lipid granülleri vakuol ve çekirdek yer almaktadır. Bir veya birden fazla çekirdek spor içeriğinde bulunabilir. Sporun olgun mantara dönüşmesinde sporlar dışarıdan aldıkları su ile şişer ve dışarıya doğru jerm tüpü denen uzantıları belirir. Bu uzantı gelişerek kendine özgü hifleri oluşturur ve bu hifler üremeden sorumlu reprodüktif hifler olarak adlandırılır. Mantarların hem
eşeysiz hem de eşeyli sporları çimlenebilir ve yeni bir hif hâline gelebilir.
Eşeysiz Üreme/Aseksüel Sporlar: Mantarlar eşeysiz üremeyi 3 farklı yol ile yapabilir: 1. Hif filamentlerini yayarak
2. Sporlarını eşeysiz üreterek
3. Mayalarda olduğu gibi tomurcuklanma yaparak
Sporangiosporlar: Sporangiosporlar, sporangiofor adı verilen hiflerin ucundaki yuvarlak sporangium keselerinin içerisinde sporangiumların patlaması sonucu oluşur.
Konidiosporlar: Konidiosporlar, konidiofor adı verilen üremeden sorumlu hifin uçlarında ve yan kısımlarında oluşur. Üremeden sorumlu hifler daha önce anlatıldığı gibi havasal hiflerin farklılaşması ile oluşur ve reproduktif hif olarak adlandırılırlar.
Klamidiosporlar: Hif hücrelerinin bazılarının aşırı gelişmesi ve hücre duvarlarının kalınlaşması sonucu protoplazmaları yoğunlaşarak klamidosporları oluşturur. Hiflerin uç, orta veya yan kısımlarında gelişirler. Mucoraceae familyasının karakteristiğidir.
Blastosporlar: Hiflerin birden fazla çeşitli yerlerinde blastospor adı verilen tomurcuklar oluşur. Blastosporlar, Ascomycetes türlerinde ve mayalarda (Saccharomyces cerevisiae) görülmektedir.
Artrosporlar; Reproduktif hiflerin septumlarının bölünerek ayrılması ile oluşurlar. Ayrılan sporlar uygun koşullarda çimlenerek aynı türü üretirler. Boyutları türden türe değişiklik göstermekte olup şekilleri oval veya silindiriktir. Dermatofit, Trichosporon, Geotrichum gibi birçok türde görülür.
Eşeyli Üreme/Seksüel Sporlar: Seksüel sporlar ya tek hücreli gametlerin ya da gametangia adı verilen özelleşmiş hiflerin birleşmesi sonucu oluşurlar. İki gametin önce çekirdekleri birleşip kaynaşarak haploid hâle gelir ve haploid kromozomlar da birleşerek diploid seksüel sporları meydana getirir.
Askosporlar: Askus olarak adlandırılan kapalı bir kese içinde oluşan sporlara askospor denir. Askosporlar aynı veya farklı hiflerdeki komşu iki hücrenin (askogonium ve anteridium) uzayarak birleşmesi sonucu oluşurlar.
Basidiosporlar: Komşu iki hücrenin uzayarak birleşmesi sonucu dört haploid çekirdek oluşur. Oluşan çekirdekler basidium adı verilen üreme hifinin uçlarında oluşan sterigmatalara girerek basidiosporları oluştururlar.
Zigosporlar: Aynı mantar üzerinde bulunan cinsiyet karakteri (erkek-dişi) olan gametangiumların uzayarak birleşmesi ve genetik değişimi sonucunda zigosporlar olu- şur. Önce hücreler arası bölmeler kaybolur ve çekirdekler
birleşir. Oluşan sporun etrafı kalın koruyucu tabaka ile çevrilir.
Mantarların Sınıflandırılması/Filogenisi
Mantarlar hayvanlarla diğer ökaryotik gruplara daha yakın akrabalık göstermekte olup ortak atayı paylaşmaktadırlar. Beşli alem sisteminde mantarlar, Fungi Alemi içerisinde sınıflandırılmaktadır.
Mantarlar; mayaları, küfleri ve şapkalı mantarları içeren ökaryotik organizma grubudur. Hücre zarında kolesterol yerine ergosterol bulundurması mantarları diğer ökaryot organizmalardan ayıran temel özellik olup diğer bir önemli özellikleri sert hücre duvarı yapısı kitin ve glukandan oluşmasıdır. Ayrıca mantarların 80S büyüklüğünde ribozoma sahip olmaları da onları hem diğer mikroorganizmalardan hem de ökaryotlardan ayıran özellikleridir. Tüm mantarların son ortak atası muhtemelen 450 milyon ile 1,5 milyar yıl önce var olduğu düşünülmektedir. Şimdiye kadar çevresel örneklerden çok çeşitli mantar türü izole edilmiş, DNA dizilerinin filogenetik analizleri yapılmış olsa da yer yüzünde keşfedilmeyi bekleyen %90’dan fazla mantar türü bulunmaktadır. Mantarların incelendiği bilim dalı mikoloji olarak adlandırılırken ve mantarları inceleyen kişiler de mikolog olarak adlandırılmaktadır.
Microsporidia: Mikrosporidiler, hayvan ve protist konakçı hücre paraziti olarak yaşayan, küçük (2-5 μm), tek hücreli canlılardır. Çok önceleri Protist aleminde sınıflandırılırken moleküler çalışmalar Mikrosporidilerin, Chytridiomycota ile ortak atayı paylaşabileceğini gösterdikten sonra Fungi alemine dahil olmuşlardır. Mikrosporidiler sadece konakçı hücrelerin içinde büyüyen ve üreyen zorunlu parazitlerdir. Konakçının dışındayken spor olarak var olurlar.
Chytridiomycota: Mantarlar aleminin en basit yapılı ve en erken farklılaşan grubudur (Madigan ve ark., 2019). Yüzme yeteneğine sahip mantarlar grubunu oluşturmaktadır. Bu grubun üyeleri mikroskobik boyutlarda olup bazıları tek hücreli diğerleri ise çok çekirdekli yapılardan oluşmaktadır. Chytridiomycota grubuna ait türler isimlerini, farklı yapılarda olan zoosporlarından almaktadır.
Zygomycota: Zigomisetler suda yaşayan Chytridlere tüm kara mantarları arasında en fazla benzerlik gösteren gruptur. Bu benzerlikler, mantarların 400 milyon yıldan daha uzun bir süre önce sudan karaya nasıl taşındığına dair çalışmalarda bu mantarları önemli kılmaktadır. Sadece yaklaşık 1100 Zigomiset türü adlandırılmış ve tanımlanmış olup yaşam tarzı açısından son derece çeşitlidir.
Glomeromycota: Glomeromycota filumu 157 isimlendirilmiş mantar türünü içeren, zorunlu simbiyotik mantar grubudur (http-2). Glomeromycota türlerinin çoğu bitkilerin endomikorizal simbiyontları olup kritik ekolojik öneme sahiptirler. Yabani bitkilerin %80’inden fazlasının, mantar simbiyontları olduğu tahmin
edilmektedir ve bu ilişki ilkel bitkilerin sudan çıkıp kuru toprakları fethetmeye başlamasından önce başlamış olabileceği düşünülmektedir.
Ascomycota: Ascomycota, 33.000 tanımlanmış türü içeren, Fungi aleminin en büyük ve en çeşitli filumudur. Tüm mantar türlerinin neredeyse %50’sini içerir ve tıbbi öneme sahip mantarların %80’ini bu filumun üyesidir (Murray ve ark., 2021). Askomiset ismini, karakteristik üreme yapıları olan askus (kese) yapılarından almıştır. Askomisetler sucul (tatlı su, deniz) ve karasal ortamlarda bulunur.
Basidiomycota: Basidiomycota, 30.000’den fazla tanımlanmış türü içeren büyük bir mantar grubudur. Grup üyeleri is, pas, jöle mantarları, mayalar ve şapkalı mantarlardan oluşmaktadır. Moleküler filogenetik analizler, Basidiomycotaları diğer mantarlardan ayırmada zorluk yaşamaz bunun nedeni, gözle görülür gelişimsel özelliklere sahip olması ve ortak yapısal özelliklerinin belirgin olmasıdır.
Mantarların Teşhisi
Mantarların teşhis edilmesi için önce uygun koşullarda kültüre edilmeleri gerekmektedir. Mantarların üremesi bakterilere göre yavaş bir şekilde 1-3 hafta arası süreçlerde olmaktadır. Mantar inoküle edilmiş besiyerleri 25-27°C sıcaklıklarda inkübe edilmektedir.
Mantarların Makroskobik Analizi
Mantarlar genetik özelliklerine göre tanımlanmadan önce makroskobik morfolojilerine göre tanımlanırlar. Mantarların koloni yapıları ve misel yapıları mantarların karakterize edilip tanımlanmasında büyük rol oynamaktadır. Mantarların bu yapılarını gözlemlemek için uygun koşullarda (sıcaklık, besiyeri, inkübasyon süresi) geliştirilmeleri ve tüm sürecin gözlemlenmesi gerekmektedir. Mantarların gelişimleri sırasında oluşturdukları farklı koloni tipleri vardır. Miselyal koloniler, yuvarlak, oval, elips şeklinde düzensiz şekiller ve renklere sahip olabilirler. Bazı dermatofit (Microsporum, Trichophyton) türleri ve bazı enfeksiyon sebebi mantar türleri 20- 25°C sıcaklıklarda miselyal koloni morfolojisi verirler. Bazı başka dermatofitler (T. schoenleini ve T. verrucosum) ise ince deri gibi membranöz koloni özelliği göstermektedir. Maya benzeri koloniler, yumuşak, mukoid ve kabarmış yuvarlak görüntü verirler. Saccharomyces cinsine ait türler 37 °C sıcaklıkta bu tipte gelişirler. Granüler kolonilerde ise çok fazla spor gelişmekte olup gelişen sporun tipine bağlı ince veya kaba granülasyon gözlemlenebilmektedir. Dermatofitlerden E. floccosum ve M. gypseum bu tip kolonilere örnek verilebilir. Pleomorfik koloni özelliği de laboratuvarda uzun süre kullanılan ve kullanımı için çok kez pasajlanan mantar türlerinde görülmektedir.
Mantarların Mikroskobik Analizi
Mantarların direkt mikroskopisi için uygulanan farklı solüsyonlar ile birlikte farklı boyama yöntemleri kullanılmaktadır. %15’lik NaOH veya KOH solüsyonları mantar hücresinin kitin tabakasının çözülmesi ve hiflerin ortaya çıkması sağlar ve örneklerin direkt mikroskobik incelenmesi için kullanılır. Laktofenol pamuk mavisi boyama yönteminde, mantar hifleri ve sporlarını incele- mek amacıyla kullanılmaktadır. Çini mürekkebi ile boyama yönteminde ise kapsüllü mantarların (Cryptococcus neoformans) teşhisi için kullanılır.
Mantarların Moleküler Filogenetik Analizi
Mantarlar arasındaki evrimsel ilişkiler, ökaryot genlerinin dizilimlerinin karşılaştırılmasıyla incelenmektedir. Ribozomal gen kümesinin incelenmesi, bu araştırma için en yaygın seçimdir. Bu küme, ribozomal RNA’nın üç alt birimini (18S [küçük alt birim (SSU)], 5.8S ve 28S [büyük alt birim (LSU)] rRNA) ile araya giren bölgeler ITS1 ve ITS2 olarak tanımlanan dâhilî transkripsiyonlu aralayıcıları kodlamaktadır. İki ara bölge artı ribozomun 5.8S alt birimini kodlayan gen ITS bölgesi olarak adlan- dırılmaktadır. Gen kümesinin yüksek kopya sayısını elde etmek için PCR (Polymerase Chain Reaction [Polimeraz Zincir Reaksiyonu]) kullanılarak amplifikiye edilir.